揭秘：焦亡與CAR-T療法中細(xì)胞因子風(fēng)暴

    作為新發(fā)現(xiàn)的一種程序性死亡方式，焦亡備受科研界關(guān)注。細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)，也就是常說(shuō)的細(xì)胞因子風(fēng)暴，是CAR-T療法的一個(gè)常見副作用。近日，一篇發(fā)表在Science Immunology的文章闡述了CRS的發(fā)生機(jī)制，首次將焦亡與CRS聯(lián)系在一起，開拓了焦亡研究的新世界。

技術(shù)路線:

結(jié)果:
1.CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡
    從B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）患者分離的白血病細(xì)胞與識(shí)別CD19的CAR-T細(xì)胞孵育時(shí)，白血病細(xì)胞的活力減弱，而人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）特異的CAR T細(xì)胞沒(méi)有這種作用。腫瘤細(xì)胞有腫脹的外觀，質(zhì)膜產(chǎn)生大氣泡，超過(guò)30％的CD19+ B白血病細(xì)胞是PI+，在上清液中存在高水平的LDH，提示CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)CD19+ B白血病細(xì)胞發(fā)生焦亡。CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19+ Raji和NALM-6白血病細(xì)胞中有相同影響。開發(fā)一種原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)可視化細(xì)胞膜中孔的形成，觀察到與CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)后B白血病細(xì)胞膜上形成了許多孔。這些結(jié)果表明，CAR-T細(xì)胞療法可誘導(dǎo)靶腫瘤細(xì)胞焦亡。

2.CAR T細(xì)胞激活GSDME介導(dǎo)靶細(xì)胞焦亡
    GSDME在CD19+ B細(xì)胞惡性腫瘤中普遍表達(dá)，GSDME的活性形式為腫瘤細(xì)胞中的CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)。在四種類型的靶細(xì)胞敲GSDME，發(fā)現(xiàn)GSDME缺乏廢除CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的焦亡，過(guò)表達(dá)GSDME增加靶細(xì)胞的焦亡，表明GSDME介導(dǎo)CAR-T細(xì)胞觸發(fā)的腫瘤細(xì)胞焦亡。GSDME過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到GSDME缺陷的腫瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)GSDME重新表達(dá)恢復(fù)了CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，突變GSDME的重新表達(dá)不能恢復(fù)焦亡。這些結(jié)果表明，CAR-T細(xì)胞可以調(diào)節(jié)GSDME誘導(dǎo)靶細(xì)胞焦亡。

3.CAR-T細(xì)胞釋放的granzyme B激活GSDME
    caspase 3裂解在共同孵育的腫瘤細(xì)胞中裂解并激活，添加caspase 3抑制劑抑制GSDME裂解并預(yù)防腫瘤細(xì)胞焦亡。發(fā)現(xiàn)GSDME敲除并沒(méi)有影響caspase 3激活，表明GSDME作用在caspases 3下游。從T細(xì)胞溶質(zhì)釋放的granzyme B是一種將caspase 3和caspase 7激活的效應(yīng)分子。抑制CAR-T細(xì)胞中的granzyme B阻斷了腫瘤細(xì)胞中caspase 3和caspase 7激活從而抑制焦亡。穿孔素孔形成允許granzyme B進(jìn)入靶細(xì)胞的胞漿，穿孔素敲低阻止了caspase 3和caspase 7的激活，GSDME的裂解以及隨后的焦亡。這些結(jié)果表明CAR-T細(xì)胞釋放穿孔素形成孔，導(dǎo)致granzyme B進(jìn)入靶腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致激活GSDME和細(xì)胞焦亡。

4.對(duì)靶細(xì)胞的優(yōu)異親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞引發(fā)焦亡至關(guān)重要
    構(gòu)建了人類CD19識(shí)別小鼠CAR（hCD19-mCAR）和表達(dá)人CD19或人HER2的B16黑色素瘤細(xì)胞，將hCD19-mCAR T細(xì)胞與CD19-B16細(xì)胞一起孵育引起焦亡，人HER2的B16未焦亡。hCD19-mCAR T細(xì)胞與hCD19-B16細(xì)胞共培養(yǎng)后，釋放更多穿孔素/granzyme B，引起高水平的GSDME裂解，GSDME基因敲除消除了CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19-B16細(xì)胞的焦亡。添加穿孔素/ granzyme B進(jìn)入培養(yǎng)基導(dǎo)致B16焦亡。研究CD19-CAR中的共同信號(hào)域是否調(diào)節(jié)靶細(xì)胞焦亡。CD3-CAR T細(xì)胞對(duì)減細(xì)胞影響小，不誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡，另外發(fā)現(xiàn)具有不同共同信號(hào)域的CD19-CAR T都鞥誘導(dǎo)CD19-B16細(xì)胞焦亡。這些結(jié)果表明腫瘤抗原親和力和共同信號(hào)域賦予CAR T釋放大量穿孔素/粒酶引起焦亡的能力。

5.靶細(xì)胞焦亡刺激巨噬細(xì)胞釋放CRS相關(guān)細(xì)胞因子
    共培養(yǎng)（CD19-CAR T細(xì)胞和NALM-6，Raji或原代B白血病細(xì)胞）上清液處理健康捐獻(xiàn)者外周血單核細(xì)胞，觀察到IL-1β和IL-6釋放，表明CRS可以被腫瘤細(xì)胞焦亡的產(chǎn)物觸發(fā)。將CD19或HER2-CAR T細(xì)胞與GSDME-/-靶細(xì)胞共培養(yǎng)，上清液不能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β或IL-6。焦亡細(xì)胞上清液能活化巨噬細(xì)胞中Caspase 1，活化GSDMD，導(dǎo)致IL-1β和其他促炎因子的釋放，而GSDME基因敲除組上清液不能。敲低GSDMD或caspase 1消除了巨噬細(xì)胞中IL-1β和IL-6的上調(diào)。表明腫瘤細(xì)胞的焦亡激活了GSDMD介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中的炎癥途徑，導(dǎo)致釋放CRS相關(guān)的細(xì)胞因子。

6.CAR T細(xì)胞療法通過(guò)GSDME介導(dǎo)的焦亡誘導(dǎo)CRS 
    誘導(dǎo)CRS小鼠模型，與人類CRS非常相似的反應(yīng)（高燒、體重減輕和急性蛋白如淀粉樣蛋白A3、IL-1β和IL-6水平升高）。 但是，注射GSDME-/-Raji或NALM-6細(xì)胞消除了CRS癥狀，預(yù)防CRS相關(guān)死亡率。在接受CAR T細(xì)胞治療的小鼠中，腹膜巨噬細(xì)胞caspase 1和GSDMD的激活，IL-1β、IL-6和SAA的上調(diào)。巨噬細(xì)胞耗竭或caspase 1抑制劑給藥預(yù)防了與CAR T細(xì)胞相關(guān)的CRS。原發(fā)性B-ALL白血病細(xì)胞中普遍表達(dá)GSDME，較高水平的GSDME與更嚴(yán)重的的CRS相關(guān)，高CRS患者血液中LDH水平較高，LDH水平與CRS的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明， CAR T細(xì)胞療法誘導(dǎo)B白血病細(xì)胞焦亡可觸發(fā)患者的CRS。

總結(jié)：
    1. CAR T細(xì)胞通過(guò)顆粒酶B/GSDME導(dǎo)致細(xì)胞焦亡；
    2.在CAR T細(xì)胞治療期間腫瘤細(xì)胞的焦亡可觸發(fā)CRS。