靶向療法導(dǎo)致癌細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生的根本原因！

摘要：
    耐藥性的出現(xiàn)限制了靶向療法在人類腫瘤中的功效。普遍的看法是耐藥是既成事實(shí)：開(kāi)始治療時(shí)，癌癥已經(jīng)含有耐藥性突變細(xì)胞。暴露于抗生素的細(xì)菌會(huì)暫時(shí)增加其突變率（自適應(yīng)變異性），從而提高了生存的可能性。作者調(diào)查了人類結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞是否同樣利用自適應(yīng)變異性來(lái)規(guī)避治療壓力。作者發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）/ BRAF抑制作用下調(diào)錯(cuò)配修復(fù)（MMR）和同源重組（HR）DNA修復(fù)基因，并同時(shí)上調(diào)藥物耐受性（persister）細(xì)胞中易錯(cuò)的聚合酶。在治療期間，源自患者的異種移植物和腫瘤標(biāo)本中的MMR蛋白也下調(diào)。 EGFR / BRAF抑制可誘導(dǎo)DNA損傷，增加變異性并觸發(fā)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。因此，像單細(xì)胞生物一樣，腫瘤細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)變異性來(lái)規(guī)避治療壓力。

    該文驗(yàn)證了一種假說(shuō)，即在治療過(guò)程中基因組不穩(wěn)定性的短暫增加也可能促進(jìn)對(duì)靶向療法的耐藥性，從而導(dǎo)致從頭誘變。類似的過(guò)程，會(huì)增加對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性的微生物菌株的出現(xiàn)。在穩(wěn)定的微環(huán)境中，微生物的突變率通常很低，從而避免了有害突變的積累。但是，已經(jīng)在細(xì)菌和酵母中描述了幾種由壓力引起的遺傳不穩(wěn)定性和增加的變異性的機(jī)制，稱為應(yīng)激誘變（SIM）。通過(guò)降低生長(zhǎng)速率，細(xì)菌持久性細(xì)胞可以在抗生素施加的致命應(yīng)激條件下生存。
結(jié)果一、靶向治療引起的MMR下調(diào)細(xì)胞的HR和HR水平
    作者研究了微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）人結(jié)腸直腸癌（CRC）細(xì)胞系對(duì)抗EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）抗體西妥昔單抗的反應(yīng)，西妥昔單抗與panitumumab一起被批準(zhǔn)用于治療腫瘤缺乏RAS和BRAF突變的轉(zhuǎn)移性CRC。接下來(lái)，作者評(píng)估了藥物治療后CRC細(xì)胞是否能調(diào)節(jié)DNA修復(fù)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄譜顯示，MMR基因MLH1，MSH2，MSH6以及同源重組（HR）效應(yīng)子（如BRCA2和RAD51）的表達(dá)降低（圖1A）。 EXO1（一種編碼核酸外切酶的基因，參與失配和雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)）的表達(dá)也受到了影響（圖1A）。還觀察到了MMR和HR蛋白的時(shí)間依賴性下調(diào)（圖1B）。在用靶向藥物處理過(guò)的CRC細(xì)胞中，MMR能力（MMRp）降低至與觀察到的水平相當(dāng)在LIM1215中（圖1C）。接下來(lái)，作者通過(guò)使用基于質(zhì)粒的兩步法pDRGFP / pCBASce-I分析評(píng)估細(xì)胞的HR能力。在pDRGFP質(zhì)粒穩(wěn)定表達(dá)后，作者測(cè)量了由Sce-1表達(dá)誘導(dǎo)的DSB上綠色熒光信號(hào)的產(chǎn)生。通過(guò)這種測(cè)定，用靶向療法治療后，DiFi和WiDr細(xì)胞均顯示出HR能力的顯著降低（圖1D）。

                                                        圖1. CRC細(xì)胞調(diào)節(jié)DNA修復(fù)效應(yīng)因子以響應(yīng)靶向藥物

結(jié)果二、靶向治療后CRC殘留疾病樣本中的MMR蛋白下調(diào)
    為了確定基于細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是否擴(kuò)展到患者來(lái)源的腫瘤樣品，作者選擇了六個(gè)具有野生型KRAS，NRAS和BRAF的MSS PDX模型，其中西妥昔單抗抑制EGFR導(dǎo)致腫瘤消退的程度不同，與臨床情況平行（圖2A）。免疫組織化學(xué)分析顯示，當(dāng)腫瘤處于對(duì)西妥昔單抗的最大反應(yīng)點(diǎn)時(shí)，所獲得的所有腫瘤樣品中MLH1和/或MSH2的表達(dá)均下調(diào)，但仍含有殘留的持久性物質(zhì)與安慰劑治療的對(duì)照組相比（圖2B和C）。接下來(lái)，作者調(diào)查了兩名CRC患者的臨床標(biāo)本中是否也發(fā)生了DNA修復(fù)蛋白的下調(diào)，這些患者在用FOLFOX加panitumumab治療后達(dá)到了客觀的部分應(yīng)答。在這兩種情況下，當(dāng)盡管治療仍存在有限數(shù)量的腫瘤細(xì)胞時(shí)，在診斷和最大治療反應(yīng)時(shí)縱向收集腫瘤標(biāo)本。與治療前的標(biāo)本相比，在應(yīng)答后獲得的腫瘤標(biāo)本中的MLH1和MSH2下調(diào)，證實(shí)了作者研究結(jié)果的臨床意義（圖2D）。

                                                                      圖2. CRC PDXs和靶向治療患者的MMR下調(diào)


結(jié)果三、在靶向治療后的CRC細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA損傷和易錯(cuò)DNA聚合酶
    作者對(duì)DNA損傷的常見(jiàn)標(biāo)記物Ser 139（γH2AX）處H2AX磷酸化的定量分析顯示，藥物治療后病灶陽(yáng)性核的數(shù)量呈劑量和時(shí)間依賴性增加（圖3A-B）。這些數(shù)據(jù)表明靶向療法觸發(fā)了從高保真到易錯(cuò)介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的轉(zhuǎn)變，從而潛在地增加了賦予耐藥性的突變的發(fā)生。接下來(lái)，作者探討了靶向治療后觀察到的DNA損傷的可能原因。盡管幾種化學(xué)治療劑直接產(chǎn)生DNA損傷，但干擾致癌信號(hào)的藥物（例如EGFR或BRAF抑制劑）并非直接具有遺傳毒性。某些靶向療法會(huì)增加癌細(xì)胞中的活性氧水平，可能在治療過(guò)程中造成DNA損傷。當(dāng)CRC細(xì)胞暴露于EGFR和BRAF抑制劑時(shí)，活性氧水平顯著增加（圖3C）。當(dāng)在抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸（NAC）存在下進(jìn)行靶向治療時(shí)，可以消除藥物引起的ROS水平升高（圖3C）。

結(jié)果四、干擾致癌依賴性可引發(fā)CRC的應(yīng)激反應(yīng)
在EGFR和BRAF藥理阻斷后，mTOR效應(yīng)物pS6K-p70K被下調(diào)，其動(dòng)力學(xué)與MMR和HR調(diào)節(jié)相當(dāng)（圖3D）。但是，mTOR沉默不會(huì)影響DNA修復(fù)蛋白或γH2AX的表達(dá)（圖3E）。實(shí)際上，DiFi細(xì)胞中siRNA介導(dǎo)的EGFR或KRAS的敲低以及WiDr細(xì)胞中的BRAF（+/- EGFR）導(dǎo)致DNA修復(fù)蛋白表達(dá)降低，觸發(fā)了DNA損傷和mTOR下調(diào)（圖3E）。這些結(jié)果排除了藥物誘導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑的下調(diào)可能是由于抗EGFR抗體西妥昔單抗或BRAF抑制劑dabrafenib的非特異性（脫靶）作用引起的。

                                                    圖3. 靶向治療可觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，增加ROS水平，誘導(dǎo)CRC細(xì)胞DNA損傷

結(jié)果五、靶向療法可誘導(dǎo)CRC細(xì)胞適應(yīng)性變異
    二核苷酸CArepeat微衛(wèi)星驅(qū)動(dòng)了NanoLuc酶編碼序列失讀（圖4A）。為了驗(yàn)證測(cè)定，作者首先引入了CA-將NanoLuc載體導(dǎo)入MMRd人類CRC細(xì)胞系（HCT116）和三種MMRp人類CRC細(xì)胞系（DiFi，WiDr，NCIH508）。在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下48小時(shí)后，MMRd細(xì)胞中的NanoLuc信號(hào)明顯更高（圖4B）。當(dāng)將HCT116放置在培養(yǎng)物中數(shù)天時(shí)，這種差異進(jìn)一步增加，而MMRp品系中的信號(hào)仍然很低（圖4B），這表明CA NanoLuc分析有效檢測(cè)了癌細(xì)胞中的MMR缺乏癥。MLH1 KO克隆表現(xiàn)出預(yù)期的更高水平的NanoLuc信號(hào)，證實(shí)了該測(cè)定法可以檢測(cè)DNA MMR的失活（圖4C）。接下來(lái)，評(píng)估了藥物依賴性（瞬態(tài)）MMR的下調(diào)。 EGFR和BRAF抑制導(dǎo)致生物發(fā)光的時(shí)間依賴性增加（圖4D），與DNA修復(fù)效應(yīng)子的下調(diào)和低保真聚合酶的上調(diào)平行。

結(jié)果六、靶向療法可誘導(dǎo)CRC細(xì)胞適應(yīng)性變異
    作者使用了一種記者分析方法，其中二核苷酸CArepeat微衛(wèi)星驅(qū)動(dòng)了NanoLuc酶編碼序列失讀（圖4A）。首先引入了CA-將NanoLuc載體導(dǎo)入MMRd人類CRC細(xì)胞系（HCT116）和三種MMRp人類CRC細(xì)胞系（DiFi，WiDr，NCIH508）。在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下48小時(shí)后，MMRd細(xì)胞中的NanoLuc信號(hào)明顯更高（圖4B）。MLH1 KO克隆表現(xiàn)出預(yù)期的更高水平的NanoLuc信號(hào)，證實(shí)了該測(cè)定法可以檢測(cè)DNA MMR的失活（圖4C）。接下來(lái)，評(píng)估了藥物依賴性（瞬態(tài)）MMR的下調(diào)。EGFR和BRAF抑制導(dǎo)致生物發(fā)光的時(shí)間依賴性增加（圖4D），與DNA修復(fù)效應(yīng)子的下調(diào)和低保真聚合酶的上調(diào)平行。

                                                                  圖4. 靶向治療促進(jìn)CRC細(xì)胞的誘變

結(jié)果七、靶向治療后CRC細(xì)胞的基因組改變
    為了確定在使用EGFR和BRAF抑制劑處理的CRC細(xì)胞的基因組中是否存在適應(yīng)性變異的分子證據(jù)，作者分析了DiFi和WiDr親代，持久性和耐藥性衍生細(xì)胞的全外顯子測(cè)序（WES）數(shù)據(jù)。作者還檢測(cè)到了對(duì)靶標(biāo)藥物具有抗性的CRC細(xì)胞微衛(wèi)星區(qū)域的遺傳不穩(wěn)定性增加（圖5A和B），突出了靶向治療對(duì)DNA的影響修復(fù)過(guò)程和致突變性。為了檢測(cè)非克隆細(xì)胞群體中微衛(wèi)星變化的發(fā)生，作者利用了一個(gè)高深度捕獲板高靈敏度的分析揭示了持久性和耐藥性細(xì)胞中微衛(wèi)星區(qū)域長(zhǎng)度的顯著變化（圖5C）。對(duì)西妥昔單抗耐藥的腫瘤組織的WES分析顯示，微衛(wèi)星基因組區(qū)域發(fā)生了變化，而從相應(yīng)的未治療小鼠收集的PDX腫瘤中卻不存在這種變化（圖5D和E）?？傮w而言，暴露于靶向療法的CRC細(xì)胞和CRC PDX在核苷酸重復(fù)區(qū)域中經(jīng)歷了復(fù)制保真度的損失。

                                              圖5. 適應(yīng)性突變導(dǎo)致CRC細(xì)胞在治療誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)中的遺傳不穩(wěn)定性
結(jié)論:
    EGFR / BRAF抑制可誘導(dǎo)DNA損傷，增加變異性并觸發(fā)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。因此，像單細(xì)胞生物一樣，腫瘤細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)變異性來(lái)規(guī)避治療壓力?？梢圆捎盟幚韺W(xué)或遺傳學(xué)上的抑制作用來(lái)抑制啟動(dòng)藥物驅(qū)動(dòng)的適應(yīng)性誘變的細(xì)胞機(jī)制，以減少治療過(guò)程中新變異的產(chǎn)生。這種策略可能會(huì)增加和延長(zhǎng)靶向療法的臨床療效。