踏上circRNA的潮流,探索骨肉瘤的新型治療措施

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-12-05
本研究發(fā)現(xiàn)circFIRRE是OS腫瘤發(fā)生和血管生成的主要調(diào)控因子,并從體外和體內(nèi)初步驗(yàn)證YY1-circFIRRE-miR-486-3p......


環(huán)狀RNAcircRNA)是一類特殊的非編碼RNA分子,在許多疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。而難治性轉(zhuǎn)移性骨肉瘤(OS)標(biāo)準(zhǔn)治療的臨床療效不理想,新興的抗血管生成方案仍處于嬰兒期。本研究發(fā)現(xiàn)circFIRRE是OS腫瘤發(fā)生和血管生成的主要調(diào)控因子,并從體外和體內(nèi)初步驗(yàn)證YY1-circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的調(diào)控作用。這些結(jié)果提示circFIRRE能夠作為一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和難治性O(shè)S的治療靶點(diǎn)。本研究于2022年8月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF:41.444的期刊上。

 

技術(shù)路線:


 

主要研究結(jié)果:

1.      circFIRREOS樣品和細(xì)胞中的篩選和表征

作者通過(guò)rRNA-depleted RNA-seq分析四對(duì)OS組織和正常相鄰樣本的circRNA表達(dá)圖譜。表達(dá)異常的circRNA以火山圖的形式展現(xiàn)在圖1A中。作者選出前五個(gè)表達(dá)上調(diào)的circRNA,分別是circRUNX2(hsa_circ_0003563)、circSATB2(hsa_circ_0003915)、circFIRRE(hsa_circ_0001944)、circAFF2(hsa_circ_0001947)和circBBS9(hsa_circ_0003162)。然后開(kāi)展對(duì)16對(duì)樣本中的這五種異常表達(dá)的circRNA進(jìn)行RT-qPCR分析工作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circFIRRE因OS組織和鄰近的組織差異最大而差異表達(dá)最顯著(圖1B)。擴(kuò)大樣本量至104對(duì)匹配的臨床OS樣本和鄰近正常樣本,RT-qPCR分析結(jié)果顯示,circFIRRE表達(dá)顯著上調(diào)(圖1C)。另外,F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)使用五對(duì)新鮮的患者樣本也證實(shí)了上調(diào)趨勢(shì)(圖1D)。與成骨細(xì)胞系(hFOB1.19)相比,143B、SJSA-1、HOS、U2OS和MG63這五個(gè)細(xì)胞系的circRNA表達(dá)顯著上調(diào),特別是U2OS和MG63(圖1E)。circFIRRE的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞功能中是很重要的。作者經(jīng)過(guò)核質(zhì)分離后的RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中circFIRRE表達(dá)在U2OS和MG63細(xì)胞中也顯著上調(diào)(圖1F-G),RNA FISH實(shí)驗(yàn)表明circFIRRE約有80%在細(xì)胞質(zhì)中,20%在細(xì)胞核中(圖1H)。circFIRRE的確切大小為1096 bp,其特異的反式剪接被Sanger測(cè)序證實(shí)(圖1I)。用放線菌素D處理MG63和U2OS細(xì)胞后檢測(cè)circFIRRE的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)其可以在轉(zhuǎn)錄上抑制RNA合成,circFIRRE的半衰期大于24小時(shí),比linearFIRRE在轉(zhuǎn)錄上更穩(wěn)定,linear FIRRE的半衰期小于5 h(圖1J-K),circFIRRE能抵抗RNase R酶的消化,而FIRRE在處理后很容易降解(圖1L-O)。這些結(jié)果提示circFIRRE可以在OS細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),也可能成為診斷或預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。

考慮到反剪接可能來(lái)自反式剪接或基因組重排,因而采用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)排除基因組重排的可能性。circFIRRE和linearFIRRE分別用發(fā)散引物和收斂引物在OS細(xì)胞的cDNA和基因組DNA提取物中擴(kuò)增。AGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)circFIRRE只存在于cDNA中,而不存在于基因組DNA中(圖1P-Q)。


1 識(shí)別和驗(yàn)證OS組織和細(xì)胞中下調(diào)的circFIRRE

 

2.      circRNA上調(diào)預(yù)示OS病人的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更大和不良預(yù)后

為評(píng)估總生存期(OAS)和無(wú)病生存期(DFS)的危險(xiǎn)因素,作者進(jìn)行采單因素和多因素分析。單因素分析顯示,年齡、手術(shù)方式、腫瘤轉(zhuǎn)移和circFIRRE高表達(dá)與OAS和DFS相關(guān)。在這些變量中,多因素分析顯示年齡、手術(shù)方式、circFIRRE轉(zhuǎn)移和表達(dá)升高是OS患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖2A-D)。此外,Kaplan-Meier生存曲線顯示circFIRRE高表達(dá)組的OAS和DFS比circFIRRE低表達(dá)組更低(圖2E-F)。circFIRRE的高表達(dá)水平與較短的生存期、較差的臨床結(jié)果和較高的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)(圖2G)。以上結(jié)果說(shuō)明circFIRRE可作為OS患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,參與OS的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。 


2 確定circFIRRE作為預(yù)測(cè)OS預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

 

3.      circFIRRE促進(jìn)體外OS的進(jìn)展

為調(diào)查OS的生物狀態(tài)的標(biāo)志,作者們展開(kāi)特征基因集的GSEA分析。在MG63和U2OS中建立circFIRRE穩(wěn)定敲除細(xì)胞系(圖3A)。然后,作者們執(zhí)行CCK8和EdU檢測(cè)OS細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,sh-circFIRRE細(xì)胞增殖及EdU結(jié)合顯著降低(圖3B-F)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中,circFIRRE下調(diào)降低OS細(xì)胞遷移和侵襲的能力(圖3G-I)。流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)sh-circFIRRE細(xì)胞被阻滯在G0/G1期,表明circFIRRE敲低可促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯。這些說(shuō)明circFIRRE敲低體外抑制OS腫瘤生長(zhǎng)和活性。RT-qPCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效率,并證實(shí)轉(zhuǎn)染不影響linearFIRRE表達(dá)(圖3J)。CCK8和EdU分析顯示circFIRRE過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)MG63和U2OS增殖(圖3K-O)。這些說(shuō)明circFIRRE參與體外OS的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。


3 體外circFIRRE影響OS的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

 

4.      circFIRRE誘導(dǎo)血管生成

作者推測(cè)circFIRRE在OS肺轉(zhuǎn)移中可能參與血管生成。為驗(yàn)證猜想,作者對(duì)轉(zhuǎn)移性O(shè)S組織內(nèi)皮細(xì)胞中circFIRRE是否富集進(jìn)行研究。作者們從局限性骨肉瘤患者和三個(gè)臨床轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的樣本中獲得原發(fā)性內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)CD31+磁珠分選,檢測(cè)circFIRRE在內(nèi)皮細(xì)胞中的差異表達(dá)(圖4A)。RT-qPCR分析顯示,相對(duì)于非轉(zhuǎn)移性O(shè)S中的內(nèi)皮細(xì)胞,轉(zhuǎn)移性O(shè)S中的circFIRRE顯著上調(diào)(圖4B),揭示其在血管生成和OS轉(zhuǎn)移中的潛在作用。三種常見(jiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC,EA.hy926,hmec1),HUVEC細(xì)胞circFIRRE表達(dá)水平最高。因此,作者選擇HUVEC進(jìn)行血管生成研究。將三個(gè)circFIRRE靶向siRNAs轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)si-1和si-2具有較好的敲低效果,降低50%以上的circFIRRE表達(dá)水平(圖4D)。si-1和si-2將用作后面的功能實(shí)驗(yàn)。tube formation assay再次驗(yàn)證,與對(duì)照組相比,si-circFIRRE顯著降低HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移和管形成能力(圖4E-F)。主動(dòng)脈環(huán)檢測(cè)顯示,si-circFIRRE轉(zhuǎn)染的主動(dòng)脈環(huán)在膠原中包埋7天,微血管面積較正常組小(圖4G)。CAM是一種血管高度分化的雞胚外膜,si-circFIRRE共孵育后新形成的血管明顯受損(圖4H)。這些結(jié)果表明circFIRRE下調(diào)顯著抑制血管生成。對(duì)新芽進(jìn)行tube formation assay,結(jié)果顯示circFIRRE過(guò)表達(dá)顯著增加HUVEC細(xì)胞的分支點(diǎn)和毛細(xì)血管長(zhǎng)度(圖4I-J)。CAM和主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)表明circFIRRE也能促進(jìn)血管生成(圖4K-L)。上述這些結(jié)果說(shuō)明circFIRRE可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)的新生血管形成。


4 circFIRRE誘導(dǎo)體內(nèi)、體外腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)的新生血管形成。

 

5.      YY1調(diào)控OScircFIRRE的表達(dá)

鑒于circFIRRE在OS中顯著上調(diào),作者們假設(shè)circFIRRE在人類OS發(fā)育中受上游轉(zhuǎn)錄因子(TF)調(diào)控。作者從UCUS基因?yàn)g覽器中檢索到FIRRE的啟動(dòng)子,用三種算法來(lái)預(yù)測(cè)能與啟動(dòng)子結(jié)合的潛在的TFs,發(fā)現(xiàn)Yin Yang 1(YY1)是這些算法中唯一的轉(zhuǎn)錄因子(圖5A)。然后檢測(cè)了35對(duì)OS樣本中YY1的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于相鄰的正常對(duì)照,circFIRRE在OS樣本中高表達(dá),并且與circFIRRE的表達(dá)水平呈正相關(guān)(圖5B-C)。在細(xì)胞水平上,相比于hFOB1.19細(xì)胞,MG63和U2OS細(xì)胞YY1表達(dá)相對(duì)上調(diào)(圖5D)。隨后,作者將circFIRE的啟動(dòng)子序列與JASPAR中的YY1結(jié)合基序進(jìn)行比對(duì),預(yù)測(cè)circFIRE啟動(dòng)子中2個(gè)可能的YY1結(jié)合位點(diǎn)(圖5E),并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了2個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。在野生型(WT)組中,過(guò)表達(dá)YY1后,circFIRRE啟動(dòng)子的熒光素酶活性增強(qiáng),而結(jié)合位點(diǎn)1或2的突變部分挽救了這種增強(qiáng)效應(yīng),而同時(shí)突變結(jié)合位點(diǎn)1和2時(shí),熒光素酶活性沒(méi)有顯著變化(圖5F)。為探究YY1對(duì)circFIRRE和linearFIRRE表達(dá)變化的影響,作者設(shè)計(jì)了3條YY1的siRNA,并選擇敲低效果較好的si-YY1-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖5G)。YY1敲低后,circFIRRE在MG63和U2OS中的表達(dá)顯著下調(diào),而線性FIRRE表達(dá)下調(diào)幅度最小,說(shuō)明兩組間無(wú)顯著性差異(圖5H-I),YY1過(guò)表達(dá)是相反的結(jié)果(圖5J-L)。這些結(jié)果表明YY1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用很可能主要是針對(duì)circFIRRE,而不是對(duì)線性FIRRE的調(diào)控。即:YY1可能是OS中circFIRRE轉(zhuǎn)錄的激活因子。


5 YY1激活circFIRRE轉(zhuǎn)錄。

 

6.      circFIRREOS細(xì)胞中海綿miR-486-3pmiR-1225-5p

鑒于circFIRRE主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),作者推測(cè)circFIRRE可能作為miRNA海綿中和miRNA介導(dǎo)的基因沉默。首先,針對(duì)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)的核心成分AGO2(氬氣RISC催化組件2)蛋白進(jìn)行RNA免疫沉淀。結(jié)果顯示,circFIRRE被AGO2 pull down特異性富集,而非免疫球蛋白G(IgG)(圖6A-C),提示circFIRRE可能與RISC結(jié)合并海綿化相應(yīng)的miRNA。然后應(yīng)用了五種算法預(yù)測(cè)circFIRE的潛在靶miRNA,并從數(shù)據(jù)庫(kù)間的重疊中確定miR-486-3p和miR-1225-5p為候選miRNA(圖6D)。RT-qPCR檢測(cè)circFIRRE對(duì)miR-486-3p和miR-1225-5p表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明,這兩個(gè)miRNAs在35個(gè)配對(duì)的OS樣本和細(xì)胞系中相對(duì)于鄰近的正常對(duì)照和成骨細(xì)胞的表達(dá)顯著下調(diào)(圖6E),并且與circFIRRE表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6H-I)。FISH實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這種模式(圖6F-G)。然后,通過(guò)circFIRRE敲低(si-circFIRRE-1)顯著上調(diào)miR-486-3p和miR-1225-5p的表達(dá)水平,反之下調(diào)miR-486-3p和miR-1225-5p的表達(dá)水平(圖6J-K)。這些結(jié)果表明miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中相對(duì)低表達(dá),并受circFIRRE的負(fù)調(diào)控。

此外,利用特異性生物素標(biāo)記的circFIRRE探針,通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)研究circFIRRE是否可以直接結(jié)合這兩個(gè)miRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于寡核苷酸探針,circFIRRE探針能夠特異性富集細(xì)胞裂解液中的circFIRRE、miR-486-3p和miR-1225-5p(圖6L-M)。pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,與對(duì)照探針相比,特異性生物素標(biāo)記的miR-486-3p和miR-1225-5p探針成功捕獲circFIRRE(圖6N-O)。將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-486-3p或miR-1225-5p mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照miRNA相比,miR-486-3p和miR-1225-5p協(xié)同將熒光素酶活性至少降低50%。隨后從熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中突變預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)miRNA轉(zhuǎn)染后突變的熒光素酶活性保持不變(圖6P)。在MG63和U2OS細(xì)胞中,circFIRRE與相應(yīng)的miRNAs通過(guò)雙重FISH實(shí)驗(yàn)共定位,支持了上述結(jié)果(圖6Q-R)。所有這些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE可能作為miR-486-3p和miR-1225-5p的海綿發(fā)揮作用。


6 circFIRRE充當(dāng)miR-486-3pmiR-1225-5p的海綿。

 

7.        體外circFIRRE通過(guò)miR-486-3pmiR-1225-5p-LUZP1軸促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生和新生血管形成

基于以前的研究,作者推測(cè)circFIRRE可能通過(guò)抑制兩種miRNA的保護(hù)作用,激活下游基因,促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展和新生血管形成。作者首先尋找miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中的靶基因。通過(guò)3種預(yù)測(cè)算法(miRDB、TargetScan和RNAInter)和RNA-seq數(shù)據(jù)交叉分析,發(fā)現(xiàn)LUZP1(亮氨酸拉鏈蛋白1)是重疊基因中唯一的預(yù)測(cè)基因(圖7A)。RT-qPCR驗(yàn)證正常鄰近樣本相比,LUZP1在35對(duì)臨床OS樣本中上調(diào)(圖7B),發(fā)現(xiàn)它們與miR-486-3p和miR-1225-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),與circFIRRE呈正相關(guān)(圖7C-E)。作者將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-486-3p和miR-1225-5p mimic共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞,研究這兩個(gè)miRNAs與LUZP1之間的相互作用。LUZP1 3′-UTR降低的熒光素酶活性伴隨著miRNA的過(guò)表達(dá)。相反,與LUZP1 3′-UTR突變后的對(duì)照相比,熒光素酶活性保持不變(圖7F)。研究采用RT-qPCR和Western blot進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,si-circFIRRE-1引起的內(nèi)源性LUZP1下調(diào)在mRNA和蛋白水平被miR-486-3p或miR-1225-5p抑制劑部分挽救(圖7G-H)。Wound healing assay和Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明,miR-486-3p和miR-1225-5p抑制劑明顯消除對(duì)sh-circFIRRE-1細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用(圖7I-J)。此外,tube formation assay顯示miR-486-3p和miR-1225-5p抑制劑明顯增加了si-circFIRRE-1細(xì)胞中減少的分支點(diǎn)和毛細(xì)血管長(zhǎng)度(圖7K-L)??傊@些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE在體外至少部分通過(guò)miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路促進(jìn)OS進(jìn)展和新生血管形成。


7 體外circFIRRE通過(guò)miR-486-3pmiR-1225-5p-LUZP1軸促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生和新生血管形成。

 

8.      circFIRRE通過(guò)海綿化miRNA促進(jìn)OS腫瘤的原位發(fā)生和體內(nèi)轉(zhuǎn)移

為驗(yàn)證circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p軸在體內(nèi)的功能,研究構(gòu)建原位異種移植瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型。將熒光染料標(biāo)記的MG63細(xì)胞注入右脛骨骨髓腔,建立原位異種移植瘤模型(每組10個(gè))。熒光素酶強(qiáng)度顯示circFIRRE敲低明顯降低原位腫瘤大小,抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖,而miR-486-3p和miR-1225-5p抑制減輕這種損傷(圖8A)。在注射后5周進(jìn)行micro-CT掃描和三維重建以評(píng)估腫瘤發(fā)生引起的骨破壞情況。結(jié)果表明,對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重的脛腓骨和關(guān)節(jié)破壞,sh-circFIRRE組骨破壞減輕,而miR-486-3p和miR-1225-5p海綿拯救了sh-circFIRRE的修復(fù)(圖8B)。注射后5周,處死小鼠,獲取OS病灶進(jìn)行免疫組化(IHC)和蛋白分析。IHC結(jié)果顯示,細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki-67顯示腫瘤增殖活性減弱,間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和顯示EMT能力受到抑制。在shcircFIRRE-1組中Vimentin和上皮標(biāo)志物E-cadherin,而這些腫瘤特征被miRNA海綿拯救(圖8C)。在sh-circFIRRE-1組中觀察到LUZP1的蛋白水平相對(duì)于對(duì)照組下調(diào),而在IHC和Western bolt分析中抑制miR-486-3p和miR-1225-5p部分消除了下調(diào)(圖8D-E)。

為了進(jìn)一步研究circFIRRE如何調(diào)節(jié)腫瘤肺轉(zhuǎn)移和血管生成,作者通過(guò)將穩(wěn)定的熒光素酶標(biāo)記的MG63細(xì)胞注射到裸鼠的側(cè)尾靜脈中(每組10只小鼠),構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型。注射后4周,根據(jù)IVIS實(shí)驗(yàn)中熒光素酶的強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠肺野內(nèi)有彌漫性轉(zhuǎn)移;sh-circFIRRE組的肺區(qū)相對(duì)清晰,無(wú)廣泛轉(zhuǎn)移;與sh-circFIRRE組相比,沉默miR-486-3p和miR-1225-5p顯著增加了肺轉(zhuǎn)移的程度和轉(zhuǎn)移病灶的大小(圖8F)。同樣,micro -CT掃描和三維重建顯示,與對(duì)照組相比,sh-circFIRRE組的腫瘤體積和數(shù)量顯著減少(圖8G-I),而與sh-circFIRRE組相比,sh-circFIRRE和miRNAs海綿組的轉(zhuǎn)移病灶體積和數(shù)量增加。切除的肺在光照和蘇木精和伊紅染色下的照片進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論(圖8J-K)。轉(zhuǎn)移OS中VEGF和CD31染色顯示,對(duì)照組和miRNAs海綿組的血管生成均被顯著激活,而在sh-circFIRRE-1組中血管生成被抑制(圖8L-M)。IHC和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)移灶中LUZP1表達(dá)的相應(yīng)變化(圖8N-O)。所有這些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE通過(guò)在體內(nèi)吸附miR-486-3p / miR-1225-5p促進(jìn)骨肉瘤的原位生長(zhǎng)、肺轉(zhuǎn)移和血管生成。


8 circFIRRE通過(guò)海綿化miRNAs促進(jìn)OS腫瘤的原位發(fā)生和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

  

結(jié)論

總之,與相鄰的正常樣本相比,OS患者樣本中circFIRRE表達(dá)上調(diào)。circFIRRE表達(dá)升高與不良臨床表現(xiàn)呈正相關(guān)。體外和體內(nèi)初步驗(yàn)證了YY1-circFIRRE-miR-486-3p/ miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的調(diào)控作用。研究首次闡明circFIRRE在OS腫瘤發(fā)生和血管生成中的作用,可能為難治性O(shè)S等腫瘤中circRNAs的分子生物學(xué)、診斷和治療研究提供有用的參考。

 

參考文獻(xiàn)

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