6張圖一區(qū)15分文章——T細胞外泌體過表達嗜酸性粒細胞陽離子蛋白誘導干擾素-γ和組織炎癥

T細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的發(fā)病機制中起關鍵作用。SLE患者血清來源的外泌體增加，并與疾病嚴重程度相關。作者確定嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP，也稱為人RNase III)在SLE T細胞衍生的外泌體中過度表達。迄今為止，ECP在T細胞功能和自身免疫性疾病發(fā)病機制中的作用仍然未知。在這項研究中，作者表征了來自SLE患者的T細胞衍生的外泌體，并將ECP鑒定為致病性外泌體蛋白。該研究于2022年1月發(fā)表在《Arthritis & Rheumatology》，IF：15.483。

技術路線：

主要研究結果：

1. SLE患者T細胞衍生外泌體中CD9和CD63表面標志物的鑒定

在收集T細胞衍生的外泌體之前，純化和培養(yǎng)SLE患者和健康對照的外周血T細胞72小時。為鑒定SLE患者中富集的外泌體表面蛋白，對T細胞上清液中的外泌體進行MACSPlex檢測(圖1A)。與健康對照組(n=12)相比，SLE患者(n=12)的T細胞上清液中T細胞衍生的外泌體數量顯著增加。在37種表面蛋白中，16種外泌體表面蛋白在SLE患者中增加(圖1B)。SLE患者中T細胞衍生的CD9+、CD63+、CD62P+和CD45+外泌體數量較高(信號大于20%)，并且與健康對照組相比顯著增加(圖1B和C)。CD9和CD63是2個眾所周知的外泌體表面標志物；有趣的是，與對照組相比，T細胞衍生的CD9+和CD63+外泌體在SLE患者中的誘導倍數最高。

圖1. SLE患者中T細胞衍生的CD9+和CD63+外泌體數量增加

2. SLE患者的T細胞衍生外泌體中存在ECP

為表征來自SLE患者的T細胞來源的外泌體的特性，通過基于質譜的蛋白質組學分析了從SLE患者和健康對照中分離的T細胞來源的CD9+和CD63+外泌體。蛋白質組學數據顯示，SLE患者的T細胞衍生的CD9+外泌體和CD63+外泌體中分別過表達了130和140種蛋白質，而健康對照組則沒有(圖2A)。此外，在富含類風濕關節(jié)炎(RA)的外泌體中也觀察到了許多鑒定的外泌體蛋白。在SLE患者中，只有15個CD9+外泌體蛋白和21個CD63+外泌體蛋白選擇性富集，而RA患者則沒有(圖2A)。值得注意的是，在質譜分析中包括的所有5個SLE患者樣本的T細胞外泌體中都檢測到了一種蛋白評分最高的外泌體蛋白ECP(圖2B)。

圖2. SLE患者T細胞衍生的CD9+和CD63+外泌體中ECP的誘導

3. Lck-ECP-轉基因小鼠出現嚴重炎癥

為研究富含SLE的外泌體ECP是否在SLE的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，作者生成并表征了Lck-ECP-轉基因小鼠。ECP在來自Lck-ECP-轉基因小鼠的T細胞衍生的外泌體中成功過表達(圖3A)。T細胞衍生的外泌體的直徑大多小于200 nm(圖3B)。與同齡的野生型小鼠相比，兩個月大的Lck-ECP-轉基因小鼠的血清促炎細胞因子IFN-γ水平自發(fā)升高(圖3C)。2個月大的Lck-ECP-轉基因小鼠的血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平沒有顯著升高，而8個月大的Lck-ECP-轉基因小鼠的血清IL-1β和TNF-α水平升高(圖3C)。此外，通過組織學染色檢測到10個月大的Lck-ECP-轉基因小鼠表現出嚴重的肝臟、腎臟和關節(jié)炎癥(圖3D)。血清肌酐和甘油三酯水平升高也分別提示Lck-ECP-轉基因小鼠發(fā)生腎炎和肝炎(圖3E)。為研究含有ECP的外泌體是否浸潤到肝臟和腎臟的發(fā)炎組織中，從小鼠組織樣本中分離出外泌體并進行免疫印跡。結果證實Lck-ECP-轉基因小鼠組織含有ECP陽性外泌體(圖3F)。這些結果表明，Lck-ECP-轉基因小鼠自發(fā)地發(fā)展出多種組織類型的炎癥。

圖3. T細胞特異性ECP-轉基因(Lck-ECP-轉基因)小鼠自發(fā)發(fā)展為嚴重炎癥

4. 從Lck-ECP-轉基因小鼠過繼轉移T細胞衍生的外泌體后誘導受體小鼠的炎癥反應

為證明含有ECP的外泌體的病理功能，來自純化的Lck-ECP-轉基因小鼠T細胞的外泌體通過靜脈注射過繼轉移到野生型受體小鼠中。共聚焦顯微鏡顯示，來自Lck-ECP-轉基因小鼠的T細胞的外泌體(以下簡稱ECP外泌體)浸潤到野生型受體小鼠的肝臟、腎臟和爪子組織中(圖4A)。在過繼轉移ECP外泌體4周后，受體小鼠在肝臟、腎臟和關節(jié)滑膜中顯示出浸潤性免疫細胞的誘導(圖4B)。蘇木精和伊紅染色提示ECP外泌體受體小鼠出現肝炎、腎炎和關節(jié)炎(圖4B)。來自ECP外泌體受體小鼠的肝臟、腎臟和關節(jié)組織也顯示出高水平的IFN-γ(圖4C)。此外，ECP外泌體的過繼轉移刺激了野生型受體小鼠的血清肌酐和甘油三酯水平(圖4D)，分別表明受體小鼠患腎炎和肝炎。受體小鼠的血清ANA和RF水平，而非抗dsDNA水平也升高(圖4E)，表明ECP外泌體誘導自身免疫反應。總之，這些結果表明T細胞衍生的外泌體ECP有助于炎癥反應。

圖4. 從Lck-ECP-轉基因小鼠過繼轉移T細胞衍生的外泌體后WT小鼠的炎癥反應

5. 通過在T細胞中過表達ECP誘導生長激素(GH)、TNF超家族(TNFSF8)和肌聯(lián)蛋白

為了解驅動Lck-ECP-轉基因小鼠自發(fā)性炎癥的潛在T細胞反應，分離了來自8個月大的Lck-ECP-轉基因小鼠的T細胞并進行了單細胞RNA測序。Seurat的降維/聚類分析根據基因表達將來自Lck-ECP-轉基因和野生型小鼠的T細胞分為11個不同的簇(圖5A)。簇1、2、5、10和11被鑒定為CD4+T細胞，而簇3、4、6、7、8和9被鑒定為CD8+T細胞(圖5A)。T細胞中ECP過表達導致初始CD8+T細胞數量減少(第3組)、效應CD8+T細胞數量增加(第4組)和記憶CD4+T細胞數量增加(第2組) (圖5A)。在Lck-ECP-轉基因小鼠T細胞中，包括CD28和CD69在內的51個基因的表達水平顯著上調(圖5B)。在Lck-ECP-轉基因小鼠T細胞中，多個炎癥相關基因(如TNFAIP3、TNFSF8、S100a6和IFN-γ)的表達也顯著增加(圖5B和C)。這些結果表明T細胞中的ECP過表達誘導T細胞活化和炎癥反應。

圖5. 通過在T細胞中過表達ECP誘導TNF-α信號傳導和IFN-γ產生

6. 在Lck-ECP-轉基因小鼠中，濾泡輔助T(Tfh)細胞和漿B細胞數量以及自身抗體水平增加

Lck-ECP-轉基因小鼠T細胞對IL-21、CXCR5和誘導型共刺激物的mRNA有顯著誘導(圖5D)，它們是Tfh細胞的細胞標志物。值得注意的是，程序性死亡1(PD-1)mRNA水平在Lck-ECP-轉基因小鼠T細胞中沒有顯著增加(圖5D)。

為研究Lck-ECP-轉基因小鼠中Tfh細胞群或漿B細胞群是否增加，通過流式細胞術分析了鼠脾細胞和骨髓細胞。發(fā)現與野生型小鼠相比，8周齡Lck-ECP-轉基因小鼠的CD4+IL-21+T細胞和CD4+CXCR5+T細胞的百分比均增加(圖6A)；這2個T細胞亞群在16周齡小鼠中進一步增強(圖6A)。此外，在16周齡而非8周齡Lck-ECP的脾臟中，成熟B細胞(B220+CD21+)的百分比增加，而幼稚B細胞(B220+CD23+)的百分比降低(圖6B)。8周齡Lck-ECP-轉基因小鼠的骨髓中漿B細胞百分比(B220lowCD138+)適度增加，并在16周齡Lck-ECP-轉基因小鼠中進一步增加(圖6C）。與野生型小鼠相比，8周大的Lck-ECP-轉基因小鼠的血清ANA水平略有誘導，而16周大的Lck-ECP-轉基因小鼠的血清ANA水平進一步升高(圖6D)。16周齡而非8周齡的Lck-ECP-轉基因小鼠的血清RF水平也有所增加(圖6D)。這些發(fā)現表明，在Lck-ECP-轉基因小鼠中誘導Tfh細胞導致血漿B細胞數量增加，從而促進隨后的自身抗體產生。

圖6. 在Lck-ECP-轉基因小鼠中，濾泡輔助T(Tfh)細胞和漿B細胞數量以及自身抗體水平增加

結論：

T細胞或T細胞衍生的外泌體中的ECP過表達通過內在和外在事件誘導T細胞過度活化和促炎細胞因子產生，導致多器官炎癥和自身免疫反應。因此，過表達ECP的T細胞和含有ECP的外泌體是SLE的潛在生物標志物。