MiR-125b-5p調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的功能

TNFR2主要由CD4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)表達，特別是存在于腫瘤微環(huán)境中的Treg細(xì)胞。證據(jù)表明TNFR2在Treg的激活、擴展和表型穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用，并促進腫瘤免疫逃避。了解Treg中TNFR2表達的表觀遺傳調(diào)控可能有助于制定癌癥免疫治療的新策略。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TNFR2是miR-125b-5p的直接靶點。miR-125b-5p過表達可降低Treg的比例及其TNFR2的表達，進而通過調(diào)節(jié)代謝相關(guān)信號通路抑制其增殖和抑制功能。此外，在結(jié)腸癌荷瘤小鼠中，Ago-125b-5p顯著抑制腫瘤生長，這與腫瘤環(huán)境中Treg的減少和IFNγ+CD8+T細(xì)胞的增加有關(guān)。在人結(jié)腸癌患者中，我們證實miR-125b-5p表達下調(diào)，miR-125b-5p低水平與不良預(yù)后相關(guān)。有趣的是，miR-125b-5p的表達與TNFR2呈負(fù)相關(guān)。我們的研究結(jié)果表明miR-125b-5p具有抑制TNFR2表達和Treg免疫抑制活性的能力，從而增強抗腫瘤療效。miR-125b- 5p的這一特性可能被用于治療人類癌癥。本文于2022年9月發(fā)表于“Journal for ImmunoTherapy of Cancer”（IF=12.469）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）TNFR2是miR-125b-5p的直接靶點

為了確定miR-125b-5p對TNFR2的影響，我們利用Targetscan、miRDB、miRWalk和Starbase V.3.0等網(wǎng)站的在線資源來預(yù)測miRNAs與TNFR2 3 'UTR的假定結(jié)合。從四個數(shù)據(jù)庫的分析中得到六種常見的潛在miRNAs，如圖1A所示。為了驗證真正負(fù)責(zé)靶向TNFR2的miRNA，我們檢測了CD4+T細(xì)胞中miRNAs的表達。如圖1B所示，miR-125b-5p在CD4+T細(xì)胞中的表達明顯低于其他5種miRNAs。然后我們合成并轉(zhuǎn)染這6種miRNAs模擬物到CD4+T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)TNFR2+ Treg的比例明顯降低。有趣的是，miR-125b-5p過表達對TNFR2表達的抑制作用比其他五種過表達的要強得多(圖1C)。含有miR-125b-5p內(nèi)互補結(jié)合位點的TNFR2的3'UTR如圖1D所示。此外，我們觀察到miR-125b-5p的過表達降低了TNFR2的WT 3'UTR中熒光素酶的活性(圖1E)。這些數(shù)據(jù)表明miR-125b-5p可以直接靶向TNFR2。

2）miR-125b-5p下調(diào)Treg中TNFR2的表達

此前我們發(fā)現(xiàn)TNFR2在Treg表型和功能穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用，TNF- TNFR2信號刺激Treg的激活并增強其抑制活性。因此，miR-125b-5p可能通過下調(diào)TNFR2表達降低Treg的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，miR-125b-5p在CD4+T細(xì)胞中過表達后，FoxP3+ Treg細(xì)胞比例顯著降低40%，TNFR2表達下調(diào)40%左右(圖2A,B)。與此形成鮮明對比的是，miR-125b-5p表達的沉默導(dǎo)致Treg在CD4+ T細(xì)胞中的比例增加30%，使TNFR2表達增加~25%(圖2C,D)。有趣的是，在miR-125b-5p過表達的Treg中，TNFR2和FoxP3的轉(zhuǎn)錄水平也顯著降低(圖2E)，而anti-miR-125b-5p處理后，TNFR2和FoxP3的表達水平升高(圖2F)。因此，我們的數(shù)據(jù)表明miR-125b-5p可以顯著降低Treg中TNFR2和FoxP3的表達。

3）miR-125b-5p抑制Treg的增殖，減弱Treg的抑制活性

有令人信服的證據(jù)表明，Treg中TNFR2表達是其免疫抑制功能所必需的。因此，miR125b-5p降低TNFR2的表達可能會減弱Treg功能。為了驗證這種可能性，對正常C57BL/6J小鼠的Treg細(xì)胞進行MACS-純化(圖3A)。結(jié)果顯示，miR- 125b-5p過表達可使Treg細(xì)胞增殖減少40%(圖3B,C)。相比之下，miR-125b-5p沉默后，Treg細(xì)胞增加30%(圖3D,E)。此外，miR-125b-5p過表達的Treg細(xì)胞的抑制活性明顯降低(圖3F,G)，說明miR-125b-5p能夠調(diào)節(jié)Treg的功能，這至少部分是由于下調(diào)TNFR2所致。

4）miR-125b-5p抑制Treg中的代謝相關(guān)信號通路

為了進一步了解miR-125b-5p對Tregs調(diào)控作用的分子基礎(chǔ)，LV-miR-125b-5p轉(zhuǎn)染Tregs的轉(zhuǎn)錄組序列呈現(xiàn)差異表達基因模式(圖4A)，其中下調(diào)112個基因，上調(diào)218個基因(圖4B)。如圖4C所示，上調(diào)最多的基因有Tnfsf4、Bmp1、Hs3st1、Cd80、Gpr162，表達下調(diào)的基因有Lag3、Ccl1、Pgk1、Cxcl9、Itga1等。GO和KEGG通路分析顯示，差異表達的基因主要參與糖酵解、碳代謝和HIF-1信號通路，這些信號通路是已知的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)因子(圖4D)。此外，GSEA分析顯示miR-125b-5p的表達影響對腫瘤細(xì)胞進展的免疫應(yīng)答(圖4E)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)進一步闡明了miR-125b-5p在調(diào)節(jié)Treg功能中的重要作用。

5）在小鼠MC38腫瘤模型中，Ago-125b-5p的抗腫瘤作用與TNFR2表達的Treg的減少有關(guān)

為了進一步研究miR-125b-5p過表達對腫瘤生長的影響，C57BL/6J小鼠皮下MC38腫瘤建立后瘤內(nèi)注射Ago-125b-5p，觀察腫瘤生長情況。結(jié)果表明，Ago- 125b-5p能顯著抑制腫瘤生長(圖5A,B)，并能有效延長荷瘤小鼠的生存時間(圖5C)。Ago-125b-5p處理后，腫瘤內(nèi)CD3+ T淋巴細(xì)胞浸潤明顯增加，并引流LNs (圖5D)，而腫瘤組織中CD8/CD4 T細(xì)胞比值增加，同時引流LNs (圖5E)。此外，Ago-125b-5p治療顯著降低了荷瘤小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF和MCP- 1的水平，而IFNγ水平升高(圖5F)。我們進一步分析Treg及其TNFR2在腫瘤環(huán)境中的表達，發(fā)現(xiàn)Ago-125b-5p處理小鼠腫瘤浸潤CD4+ T細(xì)胞中Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例顯著降低(圖6A,C)，同時Treg細(xì)胞TNFR2的表達顯著降低(圖6B,D)。有趣的是，Ago-125b-5p治療小鼠血清中TNFR2的可溶性水平降低(圖6E)。Ago- 125b-5p處理的腫瘤浸潤的CD8+ T細(xì)胞中TNFR2表達下調(diào)(圖6F)，而腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞中IFN-γ表達升高(圖6G,H)。這些結(jié)果表明表達TNFR2的Treg細(xì)胞的減少和CD8+T細(xì)胞的調(diào)動至少部分歸因于miR-125b-5p的抗腫瘤作用。

6）miR-125b-5p低表達的臨床相關(guān)性可能與人結(jié)腸癌患者TNFR2高表達相關(guān)

通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p的成熟序列在大多數(shù)脊椎動物物種中高度保守，包括人類和小鼠(圖7A)。為了預(yù)測在人類TNFR2的3'UTR中具有結(jié)合位點的假定miRNAs，我們分析了在線數(shù)據(jù)庫(Targetscan、miRDB和miRWalk)。結(jié)果表明miR-125b-5p也可以直接靶向人類TNFR2(圖7B)。根據(jù)TCGA隊列的數(shù)據(jù)，我們還發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，人類COAD腫瘤組織中TNFR2表達水平較高，miR-125b-5p表達水平較低(圖7C)。此外，對31對結(jié)腸癌腫瘤組織進行qRT- PCR分析，證實miR-125b-5p在腫瘤組織中明顯降低(圖7D)。TNFR2表達與miR-125b-5p在人類癌癥中的關(guān)系如圖7E所示。Kaplan- Meier生存分析顯示，癌癥患者預(yù)后不良與miR-125b-5p低表達相關(guān)(圖7F)。總之，miR-125b-5p與TNFR2在人腫瘤組織中的表達呈負(fù)相關(guān)。

結(jié)論：

我們的數(shù)據(jù)支持TNFR2表達下調(diào)至少部分歸因于miR-125b-5p對Treg活性的負(fù)調(diào)控。靶向miR-125b-5p可能是一種通過消除腫瘤浸潤的TNFR2表達的Treg的癌癥免疫治療新策略。

參考文獻：

Jiang M, Yang Y, Niu L, Li P, Chen Y, Liao P, Wang Y, Zheng J, Chen F, He H, Li H, Chen X. MiR-125b-5p modulates the function of regulatory T cells in tumor microenvironment by targeting TNFR2. J Immunother Cancer. 2022 Nov;10(11):e005241. doi: 10.1136/jitc-2022-005241.