一種骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移的理想生物標(biāo)志物--血漿EV-miRNA
導(dǎo)語
細胞外囊泡(EVs)已經(jīng)成為細胞間通訊的新型介質(zhì)，能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)移治療性microRNAs (miRNAs)，因此，EVs作為一種用于癌癥治療的miRNA傳遞系統(tǒng)具有巨大的潛力。此外，隨著含有mirna的EV被分泌到循環(huán)中，血漿EV中包含的mirna可能成為疾病的理想生物標(biāo)志物。本文將描述一種潛在的腫瘤抑制因子miRNA, miR-101，并探討通過EVs傳遞miR-101用于轉(zhuǎn)移性骨肉瘤體內(nèi)治療的潛力，以及血漿EV-packaged miR-101 (EV-miR-101)水平預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的潛在價值。
技術(shù)路線
1.通過原位雜交(ISH)研究miR-101在骨肉瘤中的表達與骨肉瘤進展的關(guān)系
2.利用體內(nèi)模型進一步研究了miR-101的潛在抑制作用
3.利用預(yù)測軟件分析，采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、western blotting和雙熒光素酶分析探討miR-101在骨肉瘤中的作用機制。
4.將脂肪組織來源的間充質(zhì)基質(zhì)細胞(AD-MSCs)與慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，獲得富含mir -101的EV。
5.采用Transwell實驗和骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型觀察富mir -101的EVs對骨肉瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移的影響。
6.應(yīng)用qRT-PCR檢測骨肉瘤患者和健康對照組血漿EV-miR-101水平。
研究結(jié)果:
1.miR-101的下調(diào)與骨肉瘤患者的轉(zhuǎn)移進展和不良預(yù)后相關(guān)
探討miR-101在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的作用，進行了原位雜交(in situ hybridization, ISH)來評估m(xù)iR-101的表達。數(shù)據(jù)顯示，miR-101在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤標(biāo)本中的表達明顯低于非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤標(biāo)本。根據(jù)骨肉瘤標(biāo)本中miR-101表達的ISH分數(shù)，114例骨肉瘤患者被分為高miR-101表達組和低miR-101表達組。如表所示，與高miR-101表達組相比，低miR-101表達組轉(zhuǎn)移率更高，臨床分期更晚。此外，低miR-101表達組的總生存時間也比高miR-101表達組短?？傊?，miR-101表達下降預(yù)示預(yù)后不良，可能是與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的刺激有關(guān)。
2.在體內(nèi)模型中，miR-101對骨肉瘤轉(zhuǎn)移具有抑制作用
探討miR-101是否能抑制體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移，通過慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定表達miR-101的骨肉瘤細胞系，并通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。建立體內(nèi)骨肉瘤轉(zhuǎn)移模型,sosp - 9607細胞表達mir – 101。病毒顆粒通過尾靜脈注入裸鼠實驗。7周后處死小鼠，結(jié)果顯示，與注射了nc轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞系的小鼠相比，注射了SOSP-9607-101或Saos-2-101細胞的小鼠與注射了nc轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞系的小鼠相比，轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)明顯減少，肺重量明顯降低。此外，為了排除miR-101對細胞增殖的影響，這可能影響體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的形成，我們使用CCK-8法評估慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的SOSP-9607-101和Saos-2-101細胞的增殖，并與NC細胞進行比較。結(jié)果miR-101的表達對這些骨肉瘤細胞的增殖幾乎沒有影響。
3.BCl6是miR-101在骨肉瘤細胞中的直接靶標(biāo)
鑒于mir - 101之間的序列同源性和3翻譯區(qū)(3 UTR) BCL6, 相對于數(shù)控同行， mir - 101表達升高的影響B(tài)CL6 mRNA和蛋白表達。此外，進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，結(jié)果顯示，miR-101表達的升高顯著抑制了143B細胞和Saos-2細胞中野生型BCL6 3 UTR報告基因的熒光素酶活性，但未抑制突變型報告基因的活性。qRT-PCR分析15對匹配的骨肉瘤組織和相鄰正常組織中BCL6的表達，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中BCL6 mRNA水平較相鄰正常組織升高。在15例骨肉瘤標(biāo)本中，研究了miR-101和BCL6表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-101表達與BCL6 mRNA表達呈負相關(guān)。與miR-101的作用相比，BCL6顯著增強骨肉瘤細胞的侵襲和遷移，BCL6的異位表達拯救了miR-101對骨肉瘤細胞侵襲和遷移的抑制。總之，這些數(shù)據(jù)表明，miR-101通過直接靶向BCL6來抑制細胞的侵襲和遷移。
4.miR-101可以被成功包裝成脂肪組織來源的間充質(zhì)基質(zhì)細胞(AD-MSC)來源的EV
通過流式細胞術(shù)檢測包括CD31、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105在內(nèi)的陽性和陰性間充質(zhì)干細胞(圖S2A)的表達，確認分離的AD-MSCs的純度。多重感染(MOI)的慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時后，在AD-MSCs中觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達。重復(fù)流式細胞術(shù)分析間充質(zhì)干細胞標(biāo)記物的表達，并觀察到工程化的AD-MSCs與天然的AD-MSCs之間無明顯差異。研究AD-MSCs的多向分化潛能，誘導(dǎo)其分化為脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞分別用油紅O、阿利新藍、茜素紅S染色鑒別分化的細胞。AD-MSCs與原生的AD-MSCs具有相同的多向分化潛能。miR-101在表達miR-101 (ad - ms -101)的AD-MSCs中的表達較經(jīng)qRT-PCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NC病毒顆粒(ad - ms -NC)的AD-MSCs中的表達增加。差速離心從條件培養(yǎng)基中獲得EV，透射電鏡觀察ad - msc衍生的EV和納米顆粒跟蹤分析。western blotting檢測EVs的載脂蛋白B (APOB)蛋白標(biāo)記物。ad - msc -101衍生EVs (AD-MSC-101-EVs)中miR-101的含量顯著高于AD-MSC-NC衍生EVs (AD-MSC-NC-EVs)。
5.體外培養(yǎng)的AD-MSCs中，mir -101富集的EV可抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移
143-B和Saos-2細胞有效地吸收了AD-MSC-101-EV，如143B和Saos-2細胞中miR-101水平的增加所證明的。隨后，這種攝取導(dǎo)致BCL6 mRNA和蛋白質(zhì)表達降低。與用AD-MSC-NC-EVs或等體積的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）處理的細胞相比，用AD-MSC-101-EVs處理的骨肉瘤細胞顯示出顯著降低的侵襲和遷移能力。143B和Saos-2細胞遷移的傷口愈合測定結(jié)果與Transwell測定的結(jié)果一致。
6.AD-MSCs中富含mir -101的EV可抑制體內(nèi)骨肉瘤轉(zhuǎn)移
驗證AD-MSCs中富含mir -101的EV是否具有治療體內(nèi)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的臨床潛力，將穩(wěn)定表達熒光素酶(143B-luci)的143B細胞注射到裸鼠脛骨近端形成腫瘤。2周后，AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或等量PBS分別注射到小鼠尾靜脈，每周2次，共1個月。與接受AD-MSC-NC-EVs或PBS均出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的小鼠相比，接受AD-MSC-101-EVs的6只小鼠中只有2只在腫瘤細胞注射后7周內(nèi)出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。在小鼠犧牲后，與接受AD-MSC-NC-EVs或PBS處理的小鼠相比，接受AD-MSC-101-EVs的小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和肺重量明顯減少。評價EV治療的體內(nèi)安全性，將15只裸鼠隨機分為3組(每組5只)，分別給予AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或等量PBS。在最后注射治療1周后，所有小鼠均被處死。血清學(xué)指標(biāo)檢測三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示EV治療對肝腎功能無不良影響。對主要臟器進行H&E染色，發(fā)現(xiàn)分別給予AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或PBS處理的小鼠無明顯毒性。
7. 血漿EV-miR-101顯示出作為骨肉瘤診斷性生物標(biāo)志物的潛力
對差異表達的測序的結(jié)果，血漿樣本中一個骨肉瘤病人顯示了mir – 101在血漿EV的存在,以及減少的mir - 101等離子EVs的骨肉瘤病人與健康控制。進一步驗證診斷潛在的EV - mir - 101,共檢測61例骨肉瘤患者(41例，診斷時無轉(zhuǎn)移)和健康對照組(20例)的血漿標(biāo)本。與健康對照組相比，骨肉瘤患者的EV-miR-101表達較低。此外，與無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者(n=27)相比，有轉(zhuǎn)移的患者(n=14)的miR-101水平更低然后進行受試者工作特性(Receiver operating characteristic, ROC)曲線分析，以評估血漿EV-miR-101作為診斷骨肉瘤的非侵入性生物標(biāo)志物的潛在價值。結(jié)果表明，EV-miR-101水平可有效區(qū)分骨肉瘤患者與健康對照組(ROC曲線下面積)。另外，血漿EV-miR-101水平可以區(qū)分有轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者和無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者。此外，血漿EV-packaged let-7i-5p (EV-let-7i-5p)的水平也被檢測，并顯示健康對照組和骨肉瘤患者之間沒有顯著差異。而且，無轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者與有轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的血漿EV-let-7i-5p水平無顯著差異。這些結(jié)果提示EV-let-7i-5p可作為未來骨肉瘤標(biāo)志物研究的內(nèi)源性對照。
總結(jié) :
證明了miR-101是骨肉瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移的明確抑制因子，這些作用至少部分是通過調(diào)控BCL6介導(dǎo)的。來自AD-MSCs的EV顯示出作為miR-101體內(nèi)傳遞載體的巨大潛力。血漿EV-miR-101水平也具有作為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的新的生物標(biāo)志物的激動人心的潛力，盡管這項研究由于這些樣本的稀少而受到樣本量的限制。需要進一步的研究來確定血漿EV-miR-101水平在其他更大的患者群體中的臨床價值。但其結(jié)果為EV-miR-101在骨肉瘤轉(zhuǎn)移患者新的診斷和治療策略中的潛在應(yīng)用提供了見解。