circRNA綜述：環(huán)狀RNA在膠質(zhì)瘤中的作用及臨床意義

    CircRNAs是一類具有共價閉環(huán)結構的單鏈RNA分子，具有高度的穩(wěn)定性、豐度、保守性和顯示組織/發(fā)育階段特異性表達等特點，此外，基于不同體液或外泌體中的豐度，CircRNAs為癌癥的診斷和預后提供了新的生物標志物和靶點。近年來，miRNAs和RBPs海綿、翻譯以及轉錄和剪接調(diào)控等生物發(fā)生和分子功能的調(diào)控機制逐漸被揭開，盡管許多方面仍有待結合深序列和生物信息學來闡明。越來越多的研究表明，CircRNAs在神經(jīng)元組織中更加豐富，部分原因是促進環(huán)化的特異性基因的豐度較高，這表明CircRNAs的失調(diào)與包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。
    近期，一篇名為“Functions and clinical significance of circular RNAs in glioma”的綜述文章在Molecular Cancer（IF=10.679）上發(fā)表，就膠質(zhì)瘤的生物發(fā)生、功能、數(shù)據(jù)庫以及分子通路方面的最新進展作總結，強調(diào)其作為膠質(zhì)瘤診斷或治療靶點的重要價值。

一、circRNA的生物發(fā)生和調(diào)控

圖一：該代表圖總結了circRNA的形成模型 a三種典型的環(huán)化形式。內(nèi)含子配對驅動的環(huán)化是由順式作用的調(diào)控元件介導的，其中包括反向互補序列(Alu重復)，從而促成側翼內(nèi)含子的直接堿基配對。套索驅動環(huán)化，內(nèi)含子對的套結形成使外顯子通過后向剪接跳過，形成ecircRNA或eIciRNA。反式作用因子，如RNA結合蛋白(RBPs)或幾種與側翼內(nèi)含子特定序列基序結合的剪接因子，促進CircRNA的生物發(fā)生。富GU和富C元素有助于在規(guī)范剪接后產(chǎn)生內(nèi)含子RNA。 b基因間環(huán)狀RNA是由基因間的遠距離區(qū)域產(chǎn)生的。 c 環(huán)狀LINC-PINT外顯子的形成。

二、環(huán)狀RNA的功能

圖二：CircRNA的潛在功能。CircRNA可作為miRNA海綿，調(diào)節(jié)相關靶基因的表達。CircRNA可以調(diào)節(jié)其親本基因的轉錄和剪接。CircRNA可以結合幾種蛋白質(zhì)來介導其作用。豐富的IRES和M6A修飾可以促進多種CircRNA的翻譯，尤其是GBM的豐富。CircRNAs也可以作為存在于血清和其他體液中的分子生物標記物，突出顯示對包括癌癥在內(nèi)的疾病進行診斷和治療的重要價值。
1. CircRNA充當miRNA海綿或競爭性內(nèi)源RNA
    MiRNA介導的mRNA和相關信號通路的失調(diào)與癌癥的進展和治療抗性密切相關。CircRNA可以作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNAs)或miRNA海綿來抑制miRNA，從而通過MREs上調(diào)靶基因的表達(圖2)。
2. 核circRNA調(diào)節(jié)轉錄和剪接
    環(huán)核糖核酸的加工自然影響其線性同源物的選擇性剪接，并與pre-mRNA剪接競爭，這表明CircRNA與其線性異構體之間存在負相關關系。例如，CircMb1來源于MBL第二外顯子的環(huán)化，它可以與線性MBL mRNA競爭，以維持典型剪接和環(huán)核糖核酸生產(chǎn)之間的平衡。另一種核保留的CircSEP3也被發(fā)現(xiàn)通過RNA：DNA雜交體或R-loop來調(diào)控其線性對應物的剪接，上述這些研究表明一些定位的核環(huán)狀核糖核酸可以調(diào)節(jié)基因轉錄和剪接(圖2)。
3. CircRNA與RBP相互作用
    CircRNAs可以與不同的蛋白質(zhì)結合形成特異的CircRNA-蛋白質(zhì)復合物(CircRNPs)，從而調(diào)節(jié)相關蛋白質(zhì)的作用、蛋白質(zhì)的亞細胞定位以及親本或相關基因的轉錄(圖2)。此外，CircRNAs還可以通過與翻譯因子的特異性結合來調(diào)節(jié)其同源mRNA的翻譯。特定的circRNA可以與不同的RBPs結合，而某些circRNA對不同的RBPs也具有動態(tài)親和力。
4. CircRNAs 可被翻譯
    circRNA的翻譯在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的人類癌細胞中可能更為普遍。CircRNA和由這些circRNA編碼的肽/蛋白質(zhì)在腫瘤細胞的進展和侵襲中起著重要的作用。circRNAs編碼的肽的研究主要與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關，這表明circRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性進展中具有重要意義。
CircRNAs編碼的多肽/蛋白通常含有不到100個氨基酸，在調(diào)節(jié)腫瘤能量代謝、EMT轉移、c-Myc癌蛋白穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用。因此，這些肽/蛋白是腫瘤治療的有希望的藥物靶點或預測患者臨床預后的生物標志物，特別是在GBM(圖2)。
5. 其他功能
    由EML4-ALK融合基因產(chǎn)生的CircRNA F-CircEA可作為一種新的非小細胞肺癌液體活檢生物標志物。穩(wěn)定的CircRNAs可以被逆轉錄，并最終作為加工假基因插入宿主基因組，通過提供額外的CTCF結合位點來重塑基因組結構。CircANRIL與Peccadillo同系物1(PES1)結合，損害了核酸外切酶介導的Pre-rRNA加工和核糖體的生物發(fā)生。

三、CircRNA和神經(jīng)膠質(zhì)瘤
    CircRNA在神經(jīng)元組織中含量更高，并且在不同的大腦區(qū)域表現(xiàn)出差異表達。這種現(xiàn)象可能歸因于大量產(chǎn)生各種circRNA和剪接因子的蛋白編碼基因，以及調(diào)節(jié)circRNA形成的RBP。
1. circRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達
    越來越多的證據(jù)表明，CircRNAs的異常表達與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。共表達網(wǎng)絡的構建表明，circRNA的改變，豐富了多種癌癥相關通路，是腦癌或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的驅動因素。
2. CircRNA充當microRNA海綿，促進增殖和侵襲

圖三：circRNA介導的ceRNA網(wǎng)絡與癌基因信號通路的代表圖。目前對膠質(zhì)瘤的研究強調(diào)了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡對不同信號通路的調(diào)控關系。多種已鑒定的CircRNAs作為miRNA海綿發(fā)揮作用，隨后上調(diào)相關靶基因的表達水平。然而，這些靶基因或蛋白通過作為轉錄因子或調(diào)節(jié)蛋白等機制進一步調(diào)節(jié)與癌癥信號通路相關的下游因子。圖中主要顯示CIRC-0000177通過miR-638/FZD7激活Wnt/β-catenin途徑。CircTTBK2、CircSHKBP1和CircHIPK3分別通過miR217/HNF1β、miR544a/foxp1和miR379/foxp2激活PI3K/AKT和MARK/ERK信號通路。另外，CircNPIX通過miR34a/NOTCH1激活Notch信號通路。更重要的是，包括miR-124、miR-29和miR-654等被circHIPK3海綿化的大量mirna，影響多種信號通路，提示circRNA介導的ceRNA網(wǎng)絡通過信號通路在膠質(zhì)瘤進展中發(fā)揮重要作用。
3. CircRNA通過癌癥相關的信號通路影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲
    CircRNA的異常表達通過調(diào)節(jié)與癌癥相關信號通路密切相關的互補miRNA或靶標mRNA，如PI3K / AK / mTOR，Wnt /β-catenin，在膠質(zhì)瘤的增殖，細胞周期，侵襲和轉移中起著至關重要的作用?？偟膩碚f，與癌癥相關的通路與腫瘤發(fā)生、化療和抗輻射密切相關，識別更多參與腫瘤通路的CircRNAs對于進一步了解膠質(zhì)瘤的分子生物學和開發(fā)新的靶向治療方法具有重要意義。(圖3)。
4. CircRNA和血管生成
    缺氧和各種信號通路刺激腫瘤血管生成，缺氧也可以誘導circRNA的產(chǎn)生，而circRNA也參與了血管生成。RBPs可與CircRNA相互作用，參與腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)。最近的一項研究提出，circSMARCA5作為海綿，作用于剪切因子絲氨酸和富含精氨酸的剪切因子1 (SRSF1)，在GBM中靶向并介導VEGFA的表達，從而表現(xiàn)出抗血管生成的功能(圖3)。
5. CircRNAs是膠質(zhì)瘤診斷和預后的潛在新型生物標志物
    CircRNAs的鑒定和功能研究表明，CircRNAs可作為癌基因或腫瘤抑制基因調(diào)控下游靶基因，具有重要的臨床應用價值。與其他ncRNA相比，ncRNA除了具有獨特的共價環(huán)狀結構外，還有其他一些獨特的特征。具體地說，1）沒有5 'caps和3 'poly (A)的尾巴的結構特征使CircRNA對核酸外切酶具有抗性，半衰期大于48?h。2)大多數(shù)CircRNA的序列在不同物種間在進化上是保守的。3)CircRNA表現(xiàn)出細胞類型、組織類型和發(fā)育特異性表達。4)CircRNA是通過獨占可變剪接產(chǎn)生的，并且在真核細胞的細胞質(zhì)中大量存在。5)CircRNA在真核細胞的胞漿中大量存在。7)CircRNAs含量豐富，廣泛富集在外切體中。從臨床角度來看，CircRNA被證實廣泛存在于血液和液體(唾液、尿液、滑液)中。因此，這些特性促使CircRNAs成為膠質(zhì)瘤診斷、預后和療效評價的有價值的生物標志物。細胞外小泡(EVs、外泌體和微泡)通過將分子運輸?shù)街車h(huán)境中，從而改變或重新編程腫瘤微環(huán)境，在細胞間通訊中發(fā)揮關鍵作用。它們含有各種分子的載體，如蛋白質(zhì)/肽、mRNA、非編碼RNA和DNA，這些分子決定了它們在腫瘤進展、代謝調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和治療耐藥中的作用。此外，由于它們的高度穩(wěn)定性和特異的差異表達模式，它們被認為是很有前途的癌癥生物標記物。（表1）

    目前，miRNA通過調(diào)節(jié)特異性靶基因來調(diào)節(jié)TMZ敏感性已得到廣泛驗證。所有相關研究都將使CircRNA成為有希望的診斷/預后生物標志物和新的治療靶點。
6. CircRNA和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的免疫治療
    PD-1/PD-L1檢查點阻斷是幾種腫瘤(包括膠質(zhì)瘤)的一種很有前途的靶向策略。然而，基于膠質(zhì)母細胞瘤的低免疫原性和免疫抑制微環(huán)境，盡管PD-L1上調(diào)是膠質(zhì)母細胞瘤細胞免疫治療的預后生物標志物，但針對PD-1/PD-L1檢查點的效率低下主要歸因于腫瘤的TME，如各種基因組亞型或分子譜。因此，迫切需要RT、TMZ、抗體聯(lián)合檢查點阻斷免疫治療。miRNAs與腫瘤免疫的關系是明確的，而CircRNA與抗腫瘤免疫密切相關。根據(jù)與miRNAs、蛋白結合的理論，腫瘤外體中的CircRNA可作為腫瘤抗原激活抗腫瘤免疫，是潛在的免疫治療靶點。這些不同的理論是預測性的，CircRNA-miRNA-mRNA和其他可用的RBPs對膠質(zhì)瘤免疫調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)機制還很薄弱，值得全面和深入的探討。

四、研究策略與鑒定
    高通量RNA-seq和芯片分析促進了CircRNAs的檢測。生物信息學社區(qū)迅速發(fā)展了CircRNA探索過程，即從處理映射閱讀的自定義腳本到生產(chǎn)完整的工作流。實驗驗證是繼計算預測之后進一步研究CircRNAs功能的基礎。利用位于BSJ位點兩側的發(fā)散引物進行QRT-PCR，證實在互補DNA(CDNA)中擴增出環(huán)狀DNA，而在基因組DNA(GDNA)中沒有擴增出環(huán)狀DNA，而Sanger測序證實了連接位點的存在?；虻那贸瓦^表達同樣應用于CircRNAs功能的研究。通過反向剪接位點與同源線性RNA互補的小干擾RNA或短發(fā)夾狀RNA對線性核糖核酸的表達有潛在的影響，說明應進行嚴格控制的小干擾RNA半序列(～10?NT)替換。

五、circRNA的數(shù)據(jù)庫
    為了促進circRNA研究的分析，已經(jīng)有數(shù)個數(shù)據(jù)庫來提供巨大的有價值的信息。