來自hUMSCs的外泌體-阿爾茨海默病的治療

    減少淀粉樣蛋白β（Aβ）積累可能是阿爾茨海默病（AD）一個(gè)潛在的治療方法。微環(huán)境賦予外泌體特殊的功能生物分子，原細(xì)胞所在的微環(huán)境可將其轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞以改善病理?xiàng)l件。然而，很少有關(guān)于外泌體治療AD的報(bào)道。在此，小編為大家介紹一篇發(fā)表于Small的文章：“The Regulatory Functionality of Exosomes Derived from hUMSCs in 3D Culture for Alzheimer’s Disease Therapy”。

    3D石墨烯支架和2D石墨烯薄膜均被用作人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（huMSCs）培養(yǎng)的基質(zhì)，從中獲得上清液來分離外泌體。3D培養(yǎng)的外泌體（3D-Exo）中195種miRNAs和蛋白的水平與2D培養(yǎng)的明顯不同。因此，3D-Exo可以調(diào)控α-secretase的表達(dá)和抑制β-secretase，從而減少AD病理細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中Aβ的產(chǎn)生。3D-Exo增強(qiáng)AD小鼠的記憶和認(rèn)知功能。這些發(fā)現(xiàn)為干細(xì)胞來源的支架材料和功能性外泌體提供了新的臨床應(yīng)用。
結(jié)果：
（1）3D石墨烯支架合成及hUMSC培養(yǎng)
    三維石墨烯支架和二維石墨烯薄膜均采用化學(xué)氣相沉積法合成。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，3D支架呈整體、連續(xù)、多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率為99.5%±0.2%（圖1a）。三維支架的孔隙大小是100-300μm，石墨烯骨架的寬度是100-200μm。3D支架的厚度為1.68 mm（圖1b），而2D膜是由3-5層碳片組成。已知石墨烯薄膜具有非生理硬度，3D支架的剛度值為30±0.55 kPa。圖像顯示，3D支架在微納米尺度上具有許多波紋和褶皺（圖1c），與二維膜的光滑表面形成對(duì)比（圖1d）。
    使用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)培養(yǎng)和鑒定hUMSCs。SEM顯微照片顯示，廣泛分布的hUMSCs與2D膜和3D支架形成了強(qiáng)烈的相互作用（圖1e，f）。在2D膜上，hUMSCs表現(xiàn)出典型的擴(kuò)張形態(tài)和顯著的肌動(dòng)蛋白絲（圖1g）。相反，我們觀察到細(xì)胞在3D支架上擴(kuò)散，穿過相互連接的孔壁，并與鄰近的細(xì)胞建立物理接觸（圖1h）。

（2）外泌體及其含量特征
    在3D支架（3D- exo）和2D薄膜（2D-Exo）上培養(yǎng)的hUMSCs上清液中，通過超離心的標(biāo)準(zhǔn)方法分離出外泌體。根據(jù)透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析的結(jié)果，外泌體通常由直徑為50-150 nm的膜泡組成（圖2a）。western blotting檢測(cè)外泌體的標(biāo)記物四聚體蛋白（CD9、CD63）和核內(nèi)體途徑蛋白（Alix和TSG101）。結(jié)果顯示Alix和TSG101在外泌體中表達(dá)，而CD9和CD63同時(shí)在2D-Exo和3D-Exo中富集（圖2b）。外泌體中含有豐富的miRNA，在細(xì)胞間通訊中起著重要的作用。我們使用miRNA微陣列對(duì)外體miRNA進(jìn)行了表征。與2D-Exo相比，195種miRNA在3D-Exo中的表達(dá)存在差異。其中68個(gè)miRNA上調(diào)，127個(gè)miRNA下調(diào)，如圖2c所示。對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行GO分析和KEGG分析，我們推測(cè)這些3D-Exo中的miRNA對(duì)細(xì)胞行為、突觸、免疫和抗氧化作用至關(guān)重要。我們確定了36種miRNA可能與AD治療相關(guān)。我們通過real-time PCR進(jìn)一步檢測(cè)了miR-126-3p、miR-137、miR- 144-3p、miR-188-5p、miR-425-3p和miR-451a的水平（圖2d），趨勢(shì)變化與芯片一致。
    此外，外泌體包含各種類型的蛋白質(zhì)。本研究通過western blotting檢測(cè)NEP、IDE、HSP70和HSP90的水平。結(jié)果表明，與2D-Exo相比，3D-Exo中NEP、IDE和HSP70的含量顯著增加（圖2e）。與此同時(shí)，兩種外泌體中HSP90的表達(dá)水平無差異，且這些蛋白在hUMSCs中的表達(dá)水平無明顯變化。這些結(jié)果表明，來自于hUMSCs的外泌體的miRNA和蛋白質(zhì)受到3D支架培養(yǎng)的影響。

（3）3 D-exo減少分泌和細(xì)胞內(nèi)AβAD病理細(xì)胞模型
    為了調(diào)查外泌體對(duì)Aβ積累減少的影響，用3D-Exo或2D-Exo處理APPswe細(xì)胞。共聚焦成像顯示APPswe細(xì)胞上DiO點(diǎn)的熒光表明受體細(xì)胞具有較高的攝取效率（圖3a）。ELISA結(jié)果顯示3D-exo能更好地降低Aβ42在細(xì)胞內(nèi)的積累（圖3 b，3c）。此外，免疫熒光染色顯示，細(xì)胞內(nèi)Aβ42積累在3D-exo組顯著降低（圖3 d）。另外，在外泌體處理后，α-secretase ADAM10 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，β-secretase BACE1表達(dá)下調(diào)（圖3e，3f）。其中，3D-Exo組的效果更明顯。

（4）3D-Exo能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能
    我們?cè)?個(gè)月大的APP/ PS1轉(zhuǎn)基因小鼠右海馬區(qū)連續(xù)給予3D-Exo和2D-Exo 14 天。為了評(píng)估3D-Exo對(duì)AD小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響，外泌體給藥后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，生理鹽水（NS）處理小鼠在空間學(xué)習(xí)和記憶方面表現(xiàn)出明顯的缺陷。與NS組和2D組相比，3D-Exo處理的AD小鼠在第3天表現(xiàn)出顯著的空間學(xué)習(xí)改善。第4、5天外泌體注射組小鼠的逃逸潛伏期短于NS注射組，此外，3D-Exo組在第5天的空間學(xué)習(xí)能力優(yōu)于2D-Exo組（圖4a）。在第6天進(jìn)行空間探針測(cè)試，對(duì)小鼠的空間記憶進(jìn)行評(píng)估，并在60 s內(nèi)記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡（圖4b）。令人印象深刻的是，與注射2D-Exo的小鼠相比，3D-Exo組表現(xiàn)出更多的平臺(tái)交叉、在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間和距離（圖4c-e）。因此，3D-Exo在改善AD小鼠認(rèn)知行為方面明顯優(yōu)于2D-Exo。

（5）3D-exo緩解Aβ在APP / PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的沉積
    為了研究外泌體在小鼠大腦中的分布，我們將Dio標(biāo)記的外泌體移植到AD小鼠右海馬。熒光成像顯示，外泌體廣泛分布于腦實(shí)質(zhì)，主要集中在右海馬，而在左海馬可見少量外泌體（圖5a）。Morris水迷宮測(cè)試后，評(píng)價(jià)外泌體對(duì)Aβ沉積的影響。免疫組織化學(xué)染色圖像顯示Aβ42在外泌體處理的AD小鼠的右海馬中的積累減少。Aβ42在3D外泌體處理的小鼠海馬中沉積的區(qū)域更?。▓D5b）。接著，為了評(píng)估外泌體是否通過調(diào)節(jié)海馬體內(nèi)的分泌酶減少Aβ產(chǎn)生，ADAM10和BACE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平被檢測(cè)。RT-PCR和免疫印跡結(jié)果表明3D-Exo導(dǎo)致ADAM10 mRNA表達(dá)上調(diào)，BACE1表達(dá)下調(diào)（圖5c，5d）。

（6）3D-Exo抑制炎癥和氧化應(yīng)激
    我們分析了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，這是神經(jīng)炎癥的標(biāo)志性特征之一。小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1在AD小鼠中顯著增加。注射3D-Exo可顯著降低右側(cè)海馬Iba-1的mRNA表達(dá)。3D-Exo注射組Iba -1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞密度低于2D-Exo組和NS組（圖6a）。此外，TNF-α和IL-1β在外泌體處理的AD小鼠海馬中下調(diào)。與2D-exo組相比，TNF-α和IL-1β在3D-exo組表達(dá)水平更低（圖6b，6c）。RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，3D-Exo處理后AD小鼠HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降（6d）。這些數(shù)據(jù)表明，3D-exo可以更好的減輕炎癥、氧化應(yīng)激和減少Aβ積累。

結(jié)論：
    來自3D支架培養(yǎng)的hUMSCs的外泌體可以減少Aβ的積累、改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能。這為從3D支架上培養(yǎng)的hUMSCs獲得的外泌體用于AD和其他疾病的治療提供了新的治療干預(yù)和潛在的臨床應(yīng)用。